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Diplomarbeit

Etablierung eines induzierbaren knockdown des autophagy-related gene 8 in T. brucei

Eukaryoten können zelluläre Komponenten oder ganze Kompartimente selektiv selbstverdauen, um sich an neue Umweltbedingungen anzupassen, sich während der Differenzierung neu zu organisieren oder in Zeiten des Nährstoffmangels zu überleben. Es scheint, dass die sogenannte Autophagie in Trypanosomen, dem Erreger der afrikanischen Schlafkrankheit, in einer einfachen Form konserviert wurde. Von zwei bekannten Systemen, die für die Erweiterung und Vervollständigung von Autophagosomen verantwortlich sind, scheint in T. brucei nur eines (nämlich das ATG8-basierte System) vorhanden zu sein.

In T. brucei wurden drei potentielle ATG8-Orthologe identifiziert von denen zwei nahezu identisch sind. In dieser Arbeit wurde ein induzierbarer knockdown aller drei ATG8-Gene durch RNA-Interferenz hergestellt. Dazu wurden single marker bloodstreamform (SMB) Trypanosomen verwendet, die T7-RNA-Polymerase und Tetracyclin-Repressor exprimieren. Der verwendete RNAi-Vektor enthielt zwei T7-Promotor- und Tet-Operator-Sequenzen in entgegengesetzter Richtung, so dass unter Tetracyclin-Induktion dsRNA exprimiert werden konnte. Zunächst wurden ATG8.1 A/B double knockdown und ATG8.2 single knockdown Konstrukte in E. coli geklont. Danach wurden die PCR-Produkte ATG8.1 A/B und ATG8.2 durch PCR-Ligationstechnik zu einem dreifachen knockdown-Konstrukt verknüpft. Die korrekte Zusammensetzung aller RNAi-Konstrukte wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt. SMB-Zellen wurden mit dem p2T7.ATG8.1 A/B-ATG8.2 triple knockdown Konstrukt und p2T7.alpha-tubulin als Positivkontrolle transfiziert. Hierzu musste die Elektroporation von Blutformtrypanosomen methodisch etabliert werden. Um die ATG8-Expressionslevel durch Northern Blotting zu überprüfen mussten spezifische Sonden konstruiert werden. Dies implizierte die Notwendigkeit, die Länge der ATG8 5'-UTR durch eine 5'-RACE PCR zu bestimmen. Die Knockdown-Stämme wurden durch Northern Blotting analysiert. Zuletzt wurde getestet, welche Induktionsparameter zu den besten Ergebnissen führen.